实验一、仪器分析实验讲座

学习仪器分析实验原理、分类、安全知识等的讲座。

实验二、邻二氮菲分光光度法测定微量铁

一、实验目的

1、了解TU-1901紫外-可见分光光度计的主要构造、核心部件功能及仪器功能实现原理。

2、掌握使用紫外-可见分光光度计测量吸收曲线和吸光度的方法。

3、掌握邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法原理，学习实验条件优化方法。

二、实验原理

紫外可见吸收光谱法又称紫外可见分光光度法，它是研究分子吸收200 nm～780 nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外可见吸收光谱的产生是由于分子外层电子在电子能级间跃迁产生的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。

利用紫外可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较，这是定性分析的依据。

紫外可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI₀/I=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线性关系。因此，通过测定待测物质溶液对一定波长处入射光的吸光度，就可求出溶液中被测物质的浓度或含量（朗伯-比尔定律的适用条件是 ①单色光②稀溶液）。由于最大吸收波长λ_max处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λ_max的吸光度，以获得最大吸光度。

光度分析时，分别将参比溶液和待测溶液装入厚度为b的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光分别照射参比溶液和待测溶液，以通过参比溶液的透光强度为I₀，通过待测溶液的透光强度为I，根据上式，由仪器直接给出I₀与I之比的对数值即吸光度。

紫外可见分光光度计：紫外可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即

由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光，该单色光通过样品池经样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池；紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。紫外可见区都可采用石英吸收池，由于玻璃对紫外区的光有吸收，因此可见区可以用玻璃吸收池，而紫外区不行。

前往仪器标本学习室观摩721分光光度计、724分光光度计、TU-1901紫外-可见分光光度计标本。实物理解分光光度计的发展历程，重点学习单色器分光原理、仪器光路、检测器及波长调节实现等仪器核心功能。

在pH=2～9的溶液中，Fe²⁺与邻二氮菲(phen)生成稳定的桔红色配合物Fe(phen)₃²⁺：

此桔红色配合物lgK_稳=21.3，摩尔吸光系数ε₅₁₀ = 1.1×10⁴ L·mol^-1·cm^-1。而Fe³⁺也能与邻二氮菲生成3:1配合物，呈淡蓝色，其lgK_稳=14.1。为测定样品中的总铁量，需要在加入邻二氮菲显色剂之前，使用盐酸羟胺(NH₂OH·HCl)将Fe³⁺还原为Fe²⁺，其反应式如下：

2Fe³⁺+2NH₂OH·HCl→2Fe²⁺+N₂+H₂O+4H⁺+2Cl^-

测定配合物Fe(phen)₃²⁺吸光度是，控制溶液的酸度为pH≈5较为适宜。

该方法的特点：1、用分光光度法测定试样中的微量铁，目前一般采用邻二氮菲法。

  2、具有高灵敏度、高选择性，且稳定性好，干扰易消除等优点。

三、实验仪器与试剂

仪器：TU-1901型分光光度计，1 cm吸收池，10 mL 吸量管，50 mL 比色管（或容量瓶）。

试剂：100 µg/mL铁标准溶液: 准确称量0.8634 g NH₄Fe(SO₄)₂·12H₂O于烧杯中，加入80 mL 6 mol/L HCl和少量水，溶解后转移至1 L容量瓶中，以水稀释至标线，摇匀。

0.15%邻二氮菲水溶液，10%盐酸羟胺溶液（新配），HAc-NaAc缓冲溶液，6 mol/L HCl，工业盐酸（试样）。

四、实验步骤

1、打开仪器电源开关，预热一段时间后利用空白溶液进行基线校正。

2、吸收曲线的绘制和测量波长的选择：用吸量管吸取1.20 mL 100 µg/mL铁标准溶液，注入50 mL比色管中，加入1.00 mL 10%盐酸羟胺溶液，摇匀，加入2.00 mL 0.15%邻二氮菲溶液，5.0 mL HAc-NaAc缓冲溶液，用水稀释至刻度。在光度计上用1 cm比色皿，采用试剂溶液为参比溶液，在440-560 nm间，扫描吸收光谱。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，选择测量的适宜波长。

3、显色条件的选择：

（1）显色剂用量

在6支比色管中，各加入1.20 mL 100 µg/mL铁标准溶液和1.00 mL 10%盐酸羟胺溶液，摇匀。分别加入0.10、0.50、1.00、2.00、3.00及4.00 mL 0. 15%邻二氮菲溶液，然后加入5.0 mL HAc-NaAc缓冲溶液，以水稀释至刻度，摇匀。在光度计上用1 cm比色皿，在所选定的波长下，以试剂空白为参比，测定吸光度。以邻二氮菲体积为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸光度—试剂用量曲线，从而确定最佳显色剂用量。

4、工业盐酸中铁含量的测定：

（1）标准曲线的制作:

在6支50 mL比色管中，分别加入0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80 mL 100 µg/mL铁标准溶液，再加入1.00 mL 10%盐酸羟胺溶液，2.00 mL 0. 15%邻二氮菲溶液和5.0 mL HAc-NaAc缓冲溶液，以水稀释至刻度，摇匀，放置5 min。

（2）试样测定:

准确吸取一定量的（2.0 mL - 6.0 mL）工业盐酸三份，按标准曲线的操作步骤，测定其吸光度。

五、实验数据及处理

1、吸收曲线的绘制：以吸光度对波长作图，寻找最大吸收波长。

2、显色剂用量选择：以吸光度对显色剂体积作图，寻找最佳的显色剂用量。

3、以铁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（求取R²值）。

4、根据试样的吸光度，从标准曲线求出工业盐酸中铁的浓度（换算为原样中Fe的浓度）及测量结果的标准偏差。

六、实验注意事项

1、测定系列标准溶液和样品溶液时，必须使用同一只比色皿。

2、比色皿放入分光光度计样品室前，必须使用吸水纸将外表面擦拭干净。

3、比色皿在换装不同浓度溶液时，必须使用待测溶液润洗至少三次。

七、实验讨论及思考

1、如所绘制的标准曲线线性不好或标准曲线部分浓度发生偏离，请分析原因。

2、配置溶液过程中，如误用吸量管，应当如何处置？

3、实验中发现所测量吸光度均为负值，请分析原因。

八、学习资源及能力拓展

1、课后或自由时间，自行前往仪器标本学习室，依托自学多媒体教材和各仪器标本，自学分光光度计的部件、结构和功能原理。

2、在以上学习内容基础上，利用发光二极管、光电二极管为光源和检测器件，以数字万用表为信号读出器，利用激光雕刻机等设备，自行设计、制作微型化分光光度计，并设计该微型化仪器的应用对象和场景。