实验三、紫外分光光度法测定鸡蛋清中水溶性蛋白质的含量

一、实验目的

1、 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

2、 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验操作。

二、实验原理

本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。该方法具有简单、灵敏、快速，且不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。因此，在蛋白质、酶等制剂和产品的制备、品控中广泛使用。

对不同样品，利用紫外分光广度法测定蛋白质含量的准确度差异较大，主要原因为：1，不同蛋白质中色氨酸和酪氨酸的含量不同，对于与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异交大的蛋白质，误差较大。2，在生物样品中常含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质，会带来较大误差。故在实际样品测定中，采用280nm和260nm处吸收差校正杂质吸收，提高测量结果准确度：

A=1.45A₂₈₀-0.74A₂₆₀

鸡蛋中蛋白质含量可在一定程度上评价鸡蛋的质量。本实验利用标准曲线法测定鸡蛋蛋清中水溶性蛋白质含量。以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标绘制标准蛋白质的标准曲线。测定待测鸡蛋清试液的吸光度，由标准曲线可计算得对应的浓度值，即未知样的含量。

图1 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收光谱图

三、实验仪器与试剂

仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，50 mL比色管（或容量瓶），石英比色皿，5.00 mL移液管。

试剂：3 mg/mL标准蛋白质溶液，4 % NaCl溶液，待测蛋白质溶液，散养鸡蛋和笼养鸡蛋）

四、实验步骤

1、启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。

2、在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，定量测定）。

3、标准蛋白质溶液的配制和稀释

3 mg/mL标准蛋白质溶液的配制：准确称取一定量的标准蛋白质于烧杯中，4% NaCl溶解，定量转移至100mL容量瓶中，待用。

用吸量管分别吸取2.00、3.50、5.00、6.50、8.00 mL 3 mg/mL标准蛋白质溶液于5只50 mL 容量瓶中（容量瓶1，2，3，4，5），用4% NaCl溶液稀释至25.0 mL刻度处，摇匀，待用。

4、鸡蛋样品的配制和处理

将散养鸡蛋和笼养鸡蛋分别打在干燥的烧杯中（蛋清蛋黄分离，只取蛋清），将蛋清尽可能搅拌均匀，待用。

用干燥的吸管吸取并准确称取鸡蛋清0.3-0.4 g于烧杯中，用4% NaCl溶液溶解稀释，定量转移至100 mL容量瓶中，定容，摇匀（小心摇动）。平行配置三份溶液。用一次性针管和过滤器（1~2层滤纸）过滤掉鸡蛋清溶液中的不溶物，滤液放置，待用。

5、将参比溶液（4% NaCl溶液）放入参比池和样品池中，点击菜单栏的“测量”选项，选择“参数设置”，设置扫描起点为400 nm，终点为250 nm。然后点击“基线校正”。

6、吸收曲线的绘制

取一定量容量瓶3中的溶液于1 cm石英比色皿中，以4% NaCl溶液为参比溶液中，在250 nm～400 nm区间，测量其吸收光谱并找到最大吸收波长。

7、标准曲线的制作

分别移取一定量容量瓶1，2，3，4，5中的溶液于1 cm石英比色皿中，以4% NaCl溶液为参比溶液，在最大吸收波长处（约280 nm）处分别测定各标准溶液的吸光度A₂₈₀，记录所得读数，平行测定三份。

8、鸡蛋样品的测定

分别移取一定量过滤后的鸡蛋清溶液（散养鸡蛋和笼养鸡蛋各三份）于1 cm石英比色皿中，以4% NaCl溶液为参比溶液，在最大吸收波长处（约280 nm）处分别测定各鸡蛋清过滤液的吸光度A₂₈₀，记录所得读数，平行测定三份。

五、实验数据记录及处理

1、利用Origin软件，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，找出最大吸收波长。

2、以标准蛋白质溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。给出拟合曲线的方程和相关系数。

3、根据样品蛋白质溶液的吸光度，从标准曲线得出待测蛋白质的浓度。计算蛋清中蛋白质的含量（质量分数%），计算相对标准偏差。

六、实验注意事项

1、绘制标准曲线时，蛋白质溶液浓度要准确配制。

2、测量吸光度时，比色皿要保持洁净，切勿用手玷污其光面。

3、石英比色皿易碎，使用时要小心。

七、实验讨论与思考

1、紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法有何优缺点？

2、该方法能否用于测定牛奶中的蛋白质含量？

八、学习资源及能力拓展

1、你学过或能想到哪些定量测定蛋白质含量的方法，要求自行查阅文献并讨论。

2、现需要测定某火腿肠制品蛋白质含量，你能否给出实验方法建议。