实验五、荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B₂的含量

一、实验目的

1、掌握利用荧光法进行定量分析的基本原理。

2、掌握荧光分光光度计的构造原理和正确使用方法。

二、实验原理

常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。

在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：

当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：

这是荧光光谱法定量分析的理论依据。

荧光分光光度计由五部分构成，包括光源、单色器1、样品池、单色器2、检测器（两个单色器呈直角）。荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。

仪器部件中光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙灯做光源 （日立 F-7000）。单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。

维生素B₂（又叫核黄素，VB₂）是橘黄色无臭的针状结晶，维生素B₂易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。其结构为：

维生素B₂溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB₂的荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失。维生素B₂在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB₂的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

多维葡萄糖中含有维生素B₁、B₂、C、D₂及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B₁本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D₂用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B₂的测定。

三、实验仪器与试剂

仪器：荧光分光光度计，烧杯，容量瓶（50 mL），移液管，量筒，分析天平，玻璃棒。

试剂：多维葡萄糖粉，冰乙酸，维生素B₂标准溶液。

四、实验步骤

1、测量最大激发波长和最大发射波长

打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。仪器初始化完毕后，点击Method→在Analysis Method中进行参数设定→点击General,将Measurement改为Wavelength Scan→点击Instrument,将Scan Made改为Excitation(激发)并且发射波长为520 nm，激发波长定为400 nm到480 nm→点击确定得激发光谱，点击Report读出最大激发波长为446 nm。

点击Instrument，将Scan Made改为Emission(发射)→设置激发波长为446 nm，发射波长为500～600 nm→点击确定得发射光谱，点击Report读出最大发射波长为525 nm。

2、标准系列溶液的配制及其荧光强度的测量

分别准确移取10 µg/mL维生素B₂标准溶液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00于50 mL容量瓶中，各加2.0 mL冰乙酸，加水至刻度线摇匀。倒入荧光比色皿约2/3，点击Method后点击General并设置Wavelength Scan，点击Instrument并设定E_X为446 nm、E_M为525 nm、Replicates为3次。确定后各组平行测三次标准系列溶液的荧光强度，记录数据得平均值。测量下一浓度溶液时先润洗3次，然后测量。

3、多维葡萄糖粉中维生素B₂的测定

准确称0.10-0.14 g多维葡萄糖粉试剂于小烧杯中，用少量水溶解后转入50 mL容量瓶中，加冰乙酸2.0 mL，摇匀并用上述方法进行测定。

五、实验数据记录及处理

1、绘制样品激发及发射光谱，给出最大激发波长和最大发射波长。

2、用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线并给出标准曲线方程。

3、计算未知样品溶液VB₂浓度及其在原始样本中的百分含量。

六、实验注意事项

1、测量时溶液加入比色皿容积的2/3或3/4，加入过少无法遮光，加入过多容易溅湿仪器。

2、加入待测液后要用擦镜纸将外壁吸干，不要摩擦外壁。

3、为测量准确，每测一个数值要重新加入溶剂，防止因漂白作用而出现的误差。

七、思考题

1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？

2. 维生素B₂在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？